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Effettori TAL |
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Molecola del Mese di Dicembre 2014 Gli effettori TAL sono proteine modulari coapaci di leggere il DNA che possono essere usate per l'editing del DNA nelle cellule viventi  IntroduzioneLa natura è piena di sorprese e talvolta si trovano dei tesori nascosti nei posti più impensati. Qualche anno fa gli scienziati hanno scoperto uno di questi tesori in un batterio che attacca le piante: una proteina modulare che può leggere la sequenza di nucleotidi del DNA. La comprensione del funzionamento di questa proteina ha aperto la strada a tutta una serie di nuove applicazioni in medicina e biotecnologia. Ora siamo in grado di progettare una proteina per leggere ogni sequenza di DNA che ci interessi e quindi possiamo legare la proteina in punti specifici del genoma. Queste proteine sequenza-specifiche vengono usate per creare nuovi strumenti per manipolare il DNA, e forse porteranno alla messa a punto di nuovi metodi per curare le malattie genetiche Attacchi e difese Queste proteine sono chiamate Effettori TAL, un acronimo di Transcription Activator-Like, effettori simili agli attivatori della trascrizione. Molti batteri iniettano nelle cellule delle piante proteine TAL che viaggiano verso il nucleo dove attivano dei geni che rendono la pianta più suscettibile all'infezione. Alcuni tipi di batteri sintetizzano solo pochi effettori TAL mentre altri ne costruiscono e ne iniettano molte decine. Come accade spesso, comunque, alcune piante hanno sviluppato una strategia difensiva e quando vengono infettate con gli effettori TAL, attivano qualche gene specifico di resistenza. Lettori modulari del Dna Gli effettori TAL sono composti da piccoli moduli lunghi circa 34 amminoacidi ripetuti molte volte. Ognuno di questi moduli legge un nucleotide quando l'effettore TAL si lega al DNA. La proteina mostrata qui a destra, presa da un batterio che infetta il riso, ha 23 di questi moduli. Questa struttura (file PDB 3ugm) include solo la porzione che si lega al DNA, ma la proteina intera include anche una porzione che le consente di entrare nel nucleo e un'altra che attiva i geni bersaglio. TALEN di successo Anche se sono passati solo pochi anni dalla loro scoperta, i ricercatori hanno già trovato nuovi modi per usare queste proteine capaci di leggere il DNA. Per esempio, con l'ingegneria genetica, hanno creato la endonucleasi TAL (TALEN) unendo il dominio in grado di tagliare il DNA della nucleasi FokI (file PDB 1fok mostrata qui sotto in verde) ad un capo dell'effettore TAL. . . . . . . . . . . .  La FokI taglia il DNA solo se forma un dimero e quindi TALEN diventa attiva solo quando due unità si legano alle rispettive sequenze bersaglio di DNA contigue, a questo punto la nucleasi taglia entrambe le catene del DNA e quindi può essere usata per mettere fuori uso un gene specifico o anche per inserire un nuovo gene ingegnerizzato sfruttando il naturale meccanismo di riparazione del DNA della cellula. Questo approccio è stato così efficace che i ricercatori stanno applicando queste strategie ad altri tipi di molecole in grado di riconoscere il DNA come le dita di zinco (mdm 3-2007) e CRISPR-Cas9 (mdm 1-2015). Esplorando la struttura Comparando i TAL di batteri diversi, i ricercatori hanno scoperto moduli per leggere le 4 basi azotate del DNA e anche per leggere qualche base azotata modificata. Ogni modulo è composto da una piccola sequenza di 2 alfa eliche. Un amminoacido sul bordo più interno del modulo esegue la lettura toccando il bordo del nucleotide del DNA e un amminoacido vicino (non mostrato qui) lo aiuta a posizionarsi correttamente. 
L'effettore TAL mostrato qui sopra (file PDB 3v6t) è stato ingegnerizzato con 3 tipi di moduli diversi. Il primo modulo, a sinistra, usa la serina, mostrata con sfere grigie e rosse, per legare adenina. Il secondo modulo, al centro, contiene un amminoacido più piccolo, glicina, mostrata con una sfera grigia, che rende più favorevole l'interazione con la timina che possiede un gruppo ingombrante metilico. Il terzo modulo, a destra, usa acido aspartico, mostrato con grosse sfere grigie e rosse, per legare la citosina. Ulteriori ricerche hanno scoperto altri moduli per leggere la quarta base, la guanina. Nelle due immagini qui sotto, si ha una visione d'insieme, tridimensionale, dell'interazione tra effettore TAL (grigio) e DNA (giallo e beige). 
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Spunti per ulteriori approfondimenti Potete vedere la struttura di un effettore TAL ingegnerizzato prima che si leghi al DNA nel file PDB 3v6t. Ognuno dei moduli degli effettori TAL è composto da 2 alfa eliche con una piccola torsione in una che aumenta l'impaccamento tra le due eliche. Cercate di esaminare tutte le sequenze di questi effettori TAL per evidenziare questa torsione. Ogni modulo include anche una lisina e una glutammina che formano interazioni non specifiche con la catena principale del DNA, cercate di individuarle.  Bibliografia
D. Deng, C. Yan, J. Wu, X. Pan & N. Yan (2014) Revisiting the TALE repeat. Protein Cell 5, 297-306. E. L. Doyle, B. L. Stoddard, D. F. Voytas & A. J. Bogdanove (2013) TAL effectors: highly adaptable phytobacterial virulence factors and readily engineered DNA-targeting proteins. Trends in Cell Biology 23, 390-398. T. Gaj, C. A. Gersbach & C. F. Barbas (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology 31, 397-405. 3v6t, 3v6p: D. Deng, C. Yan, X. Pan, M. Mahfouz, J. Wang, J. K. Zhu, Y. Shi & N. Yan (2012) Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors. Science 335, 720-723. 3ugm: A. N. S. Mak, P. Bradley, R. A. Cernadas, A. J. Bogdanove & B. L. Stoddard (2012) The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target. Science 335, 716-719.
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