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Beta-galattosidasi |
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Molecola del Mese di Giugno 2016 La beta-galattosidasi è uno strumento potente per l'ingegneria genetica dei batteri  IntroduzioneLa beta-galattosidasi mostrata nella figura qui a lato (file PDB 1jz8) è un grosso enzima batterico che svolge diverse operazioni. La prima è quella di realizzare la prima tappa nella produzione di energia: rompe il lattosio, il comune zucchero del latte, nei due zuccheri di cui è composto glucosio e galattosio che possono così essere utilizzati dalla glicolisi. La seconda operazione è la sintesi di piccole quantità di allolattosio un isomero del lattosio (nella figura si vedono 4 molecole di allolattosio rappresentate con sfere colorate). In realtà questa è una reazione collaterale, che avviene solo quando galattosio e glucosio vengono riconnessi in modo impreciso formando un legame glicosidico tra i carboni 1 e 6 invece che 1 e 4 come nel lattosio. Questa reazione si è rivelata importante per la vita del batterio, ma ha avuto anche un ruolo centrale in molte scoperte scientifiche. La scoperta degli operoni In una famosa serie di esperimenti, lo studio dei prodotti della beta-galattosidasi ha permesso a Jacob e Monod di scoprire come funzionano gli operoni batterici. Questi scienziati hanno scoperto che l'allolattosio non è un inutile prodotto secondario della reazione, ma le cellule batteriche lo utilizzano per misurare la concentrazione di lattosio e per accendere o spegnere il repressore lac (mdm 3-2003). Quando il lattosio è abbondante, la beta-galattosidasi produce allolattosio. Questo si lega al repressore lac e lo costringe a staccarsi dal DNA permettendo la sintesi degli enzimi e dei trasportatori che utilizzano il lattosio. La beta-galattosidasi infine scinde l'allolattosio nei due zuccheri che lo compongono, glucosio e galattosio, così niente viene sprecato. Coloranti e complementazione La beta-galattosidasi si è rivelata anche uno strumento prezioso nello studio della genetica grazie a due strane caratteristiche di questo enzima. La prima è che è molto specifico nel riconoscere il galattosio nel dimero lattosio, mentre il glucosio può tranquillamente essere sostituito con altre molecole. In particolare gli scienziati hanno sostituto il glucosio con un colorante che diventa blu quando viene staccato dalla molecola di galattosio. La seconda caratteristica è che l'enzima può essere disattivato rimuovendo i primi trenta amminoacidi dalla catena proteica, ma in seguito può essere riattivato complementandolo con il peptide mancante, cioè mescolandolo al peptide mancante col quale si lega in modo non covalente.  Ingegnerizzare
i batteriI biochimici usano questi coloranti e le beta-galattosidasi troncate per capire cosa sta avvenendo all'interno di un batterio ingegnerizzato. Viene preparato un plasmide con un gene per la sintesi del peptide complementante, poi il plasmide viene trasferito nel batterio che possiede una versione troncata inattiva della beta-galattosidasi. A questo punto, se il batterio ha incorporato con successo il plasmide, sintetizza il peptide e quindi riattiva la beta-galattosidasi e la cellula si colora di blu quando viene aggiunto lattosio legato al colorante. Il plasmide viene poi modificato per inserire un gene di interesse nel mezzo della sequenza che codifica per il peptide. Se l'aggiunta del nuovo gene fallisce, il plasmide è ancora in grado di far diventare blu la cellula batterica, ma se il gene è inserito correttamente, il peptide non si può formare e la cellula resta incolore. Microscopia elettronica Oltre alle tecniche tradizionali di indagine strutturale delle proteine che si basano sulla diffrazione ai raggi X e sulla spettroscopia NMR, sta affermandosi ultimamente una nuova tecnica di crio microscopia elettronica ad alta risoluzione. Anche la beta-galattosidasi è stata studiata con questa nuova tecnica di crio-EM che ha fornito l'immagine qui a fianco (file PDB 5a1a). Questa immagine è stata realizzata combinando oltre 90.000 immagini della molecola congelata che si sono rivelate così dettagliate (2.2 A) da fornire un modello atomico dell'enzima. Esplorando la struttura La struttura dell'enzima beta-galattosidasi ha rivelato come funziona il processo di complementazione. Qui sotto è mostrata la struttura della beta-galattosidasi di Escherichia coli che è formata da quattro subunità (file PDB 1jz8). L'enzima contiene quattro molecole di allolatttosio (sfere beige e rosse) nei quattro siti attivi. Quattro copie del piccolo peptide usato per la complementazione sono visibili nelle quatto subunità, due hanno i carboni gialli e due rosa. Dato che i peptidi sono formati dai primi trenta amminoacidi di ogni catena e le subunità dell'enzima in alto e in basso sono affacciate testa a testa, due peptidi si trovano affacciati uno all'altro sia sopra che sotto, e la loro mutua attrazione stabilizza la struttura attiva tetramerica dell'enzima.  
Spunti per ulteriori esplorazioni Il meccanismo della reazione di taglio è stato studiato con complessi dell'enzima con una varietà di intermedi della reazione. Provate ad esplorare la pagina del file PDB 4v44 nel sito RCSB.org e cliccate sul pulsante “Sequence Similarity” per individuare alcune di queste strutture. Il grande enzima beta-galattosidasi si è evoluta da enzimi più piccoli che realizzavano reazioni simili. Provate a fare una ricerca nel PDB per “beta-galactosidase” per individuarne alcuni  Bibliografia5a1a: A. Bartesaghi, A. Merk, S. Banerjee, D. Matthies, X. Wu, J. L. S. Milne & S. Subramaniam (2015) 2.2 A resolution cryo-EM structure of beta-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science 348, 1147-1151. D. H. Juers, B. W. Matthews & R. E. Huber (2012) LacZ beta-galactosidase: structure and function of an enzyme of historical and molecular biological importance. Protein Science 21, 1792-1807. 1jz7, 1jz8: D. H. Juers, T. D. Heightman, A. Vasella, J. D. McCarter, L. Mackenzie, S. G. Withers & B. M. Matthews (2001) A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) beta-galactosidase. Biochemistry 40, 14781-14794.
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