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Proteina gialla fotoattiva |
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Molecola del Mese di Marzo 2017 I ricercatori hanno usato il sincrotrone e i laser a raggi X per rivelare i rapidi processi di sensibilità alla luce  IntroduzioneQuando osserviamo le proteine, dobbiamo sapere che le cose più importanti avvengono in spazi ridottissimi ed in tempi incredibilmente brevi. Questo è particolarmente vero per le proteine che reagiscono alla luce. Gli scienziati hanno dovuto inventare tecniche sempre più sensibili per osservare questi processi piccoli e velocissimi e la proteina gialla fotoattiva (PYP) è stata una delle prime che hanno studiato. PYP è una proteina piccola e solubile che si trova nei batteri porpora sulfurei che la usano per sentire la luce blu con la quale fanno una fotosintesi anaerobica. PYP si è rivelata ideale da studiare perchè forma dei cristalli grandi e stabili che fanno una buona diffrazione che ci permette di vedere in modo dettagliato quello che succede a livello atomico. Qui a fianco è mostrata la proteina gialla fotoattiva, risolta con una tecnica cristallografica in grado di cogliere stati molecolari a vita brevissima. La proteina in alto è stata colta nel suo stato fondamentale, mentre quella in basso è nello stato attivato dalla luce. Sentire la luce Il fotociclo di PYP è costituito da una serie stati che cominciano quasi istantaneamente dopo l'esposizione alla luce (in femtosecondi: 10-15 s, un milionesimo di miliardesimo di secondo) e si concludono circa in un secondo. Il centro che assorbe la luce, chiamato cromoforo, assorbe luce blu e si trasforma da una forma lineare (trans) ad una piegata (cis) in meno di un picosecondo (10-12 s). Si pensa che questo cambio di conformazione attivi altre proteine sensibili nel batterio che controllano la direzione nella quale si muove. Infine il cromoforo torna alla conformazione lineare in circa mezzo secondo, pronto per sentire un altro fotone blu. Vedere il sensore Dato che lo stato attivato dalla luce dura meno di un secondo, è impossibile osservarlo con la normale cristallografia, per questo è stato necessario utilizzare una tecnica speciale chiamata cristallografia di Laue (in onore del fisico Max von Laue). Nella normale cristallografia si usano raggi X monocromatici e si raccolgono i dati della diffrazione su un cristallo rotante. Nel metodo di Laue, invece, il cristallo viene tenuto fermo e viene illuminato con raggi X di sincrotrone di molte lunghezze d'onda contemporaneamente. Questo produce un tracciato di diffrazione molto più complicato nel quale tutti i punti del cristallo producono continuamente diffrazione durante l'esposizione e permettono di raccogliere i dati molto più velocemente. Per determinare la struttura della proteina PYP mostrata qui (codice PDB 2pyp), il cristallo è stato illuminato con un laser a luce blu e poi, dopo alcuni millisecondi, si sono raccolti i dati di diffrazione di un breve lampo di raggi X di più frequenze. In questo modo si è visto come il cromoforo e la proteina si muovono dopo aver assorbito la luce Vedere gli idrogeni  Le
strutture di PYP ottenute con la cristallografia a raggi X hanno mostrato
che il cromoforo (acido cumarico o 4-idrossicinnamico) è trattenuto
saldamente dalla proteina. E' legato covalentemente ad una cisteina da
un lato (in basso nella figura) e forma due legami idrogeno con due amminoacidi
dall'altro lato. Per osservare meglio questi legami idrogeno, i ricercatori
hanno usato sia la diffrazione di raggi X, sia la diffrazione di neutroni.
La cristallografia a raggi X vede la posizione degli elettroni nella struttura e quindi permette di determinare la posizione solo degli atomi pesanti come carbonio, azoto e ossigeno. Questo permette di misurare la lunghezza dei legami idrogeno e ha rivelato che i due legami idrogeno della PYP sono tra i più corti di tutto l'archivio PDP. La cristallografia a raggi X, però, non permette di osservare direttamente gli atomi di idrogeno. I neutroni, invece sono diffratti dai nuclei degli atomi e quindi permettono di conoscere la posizione anche degli atomi di idrogeno. La struttura di PYP ottenuta con la diffrazione di neutroni (file PDB 2zoi) ha rivelato una insolita disposizione con un atomo di idrogeno condiviso tra il cromoforo e un acido glutammico. I ricercatori hanno proposto che questa strana interazione aiuti a stabilizzare l'ossigeno carico del cromoforo. Nella figura qui a fianco si può vedere la posizione degli atomi di idrogeno (bianchi) e di deuterio (azzurri) in una struttura di PYP ottenuta con la diffrazione di neutroni. La proteina era stata posta in acqua deuterata così gli atomi di idrogeno più mobili sono stati sostituiti da deuterio. Esplorando la struttura  I
ricercatori stanno sviluppando metodi per osservare le proteine in modo
ancora più veloce. Oggi il metodo più veloce è la
cristallografia seriale al femtosecondo (10-15 s). I piccoli cristalli
della proteina sono sottoposti a un intenso flash di un laser a raggi
X che crea un tracciato istantaneo di diffrazione, ma contemporaneamente
brucia il cristallo della proteina in esame. Con questa tecnica i ricercatori
hanno creato istantanee della proteina PYP mentre il cromoforo cambia
forma da trans a cis dopo aver assorbito la luce blu. La struttura mostrata
qui è stata colta 100-400 femtosecondi dopo l'illuminazione. Cliccando
sull'immagine potete vedere un filmato che illustra il processo.==> Filmato PYP Proteine usate nel filmato: 5hd3 - stato fondamentale 5hdc - 100-400 femtosecondi 5hdd - 800-1200 femtosecondi 5hds - 3000 femtosecondi - (3 picosecondi) 4b9o - 100 000 femtosecondi - (100 picosecondi) 5hd5 - 200 000 000 femtosecondi - (200 nanosecondi) 1ts0 - 1000 000 000 000 femtosecondi - (1 millisecondo) Notate che dopo il lampo di luce blu che colpisce la proteina, la prima cosa che succede, nel giro di pochi femtosecondi, è la trasformazione del cromoforo dalla forma trans a quella cis. Subito dopo il cromoforo comincia a staccarsi dai legami idrogeno che lo tengono in posizione sulla destra e si ripiega verso il basso per trovare una nuova sistemazione. Anche la forma della proteina cambia leggermente ed è questo cambiamento strutturale che innesca gli eventi successivi. Spunti per ulteriori esplorazioni 1) Cercate “serial femtosecond crystallography” per vedere altre proteine che assorbono luce che sono state studiate con questa tecnica, come la batteriorodopsina e i fotosistemi 2) Anche altre proteine sensibili hanno domini simili a quelli di PYP che vengono chiamati domini PAS. Confrontate, per esempio, la struttura di PYP con quella della fototropina: file PDB 2z6c).  Bibliografia5hd3, 5hdc, 5hdd, 5hds, 5hd5: K Pande, CDM Hutchison, G Groenhof, A Aquila, JS Robinson, J Tenboer, S Basu, S Boutet, DP DePonte, M Liang, TA White, NA Zatsepin, O Yefanov, D Morozov, D Oberthuer, C Gati, G Subramanian, D James, Y Zhao, J Koralek, J Brayshaw, C Kupitz, C Conrad, S Roy-Chowdhury, JD Coe, M Metz, PL Xavier, TD Grand, JE Koglin, G Ketawala, R Fromme, V Srajer, R Henning, JCH Spence, A Ourmazd, P Schwander, U Weierstall, M Frank, P Fromme, A Barty, HN Chapman, K Moffat, JJ van Thor & M Schmidt (2016) Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science 352, 725-729. 4b9o: F Schotte, HS Cho, VRI Kaila, H Kamikubo, N Dashdorj, ER Henry, TJ Graber, R Henning, M Wulff, G Hummer, M Kataoka & PA Anfinrud (2012) Watching a signaling protein function in real time via 100-ps time-resolved Laue crystallography. Proceedings of the National Academy of Science USA 109, 19256-19261. 2zoi: S Yamaguchi, H Kamikubo, K Kurihara, R Kuroki, N Niimura, N Shimizu, Y Yamazaki & M Kataoka (2009) Low-barrier hydrogen bond in photoactive yellow protein. Proceedings of the National Academy of Science USA 106, 440-444. 1ts0: H Ihee, S Rajagopal, V Srajer, R Pahl, S Anderson, M Schmidt, F Schotte, PA Anfinrud, M Wulff & K Moffat (2005) Visualizing reaction pathways in photoactive yellow protein from nanoseconds to seconds. Proceedings of the National Academy of Science USA 102, 7145-7150. S Anderson, S Crosson & K Moffat (2004) Short hydrogen bonds in photoactive yellow protein. Acta Crystallographica D60, 1008-1016. 2pyp: UK Genick, GEO Borgstahl, K Ng, Z Ren, C Pradervand, PM Burke, V Srajer, TY Teng, W Schildkamp, DE McRee, K Moffat & ED Getzoff (1997) Structure of a protein photocycle intermediate by millisecond time-resolved crystallography. Science 275, 1471-1475.
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