Le proteine sono macromolecole molto complesse, la loro struttura può essere capita più facilmente con un programma di modellistica molecolare come MGL Tools. Questo programma mostra il modello tridimensionale della proteina nello schermo del computer e consente di esaminarlo e manipolarlo come se fosse un oggetto nelle nostre mani. Questo non solo ci aiuta a capire meglio il significato di struttura primaria, secondaria, terziaria e quaternaria delle proteine, ma ci permette di comprendere meglio anche altre proprietà delle proteine, come l'interazione legando - sito attivo negli enzimi o l'azione degli inibitori.
Questa lezione può essere affrontata in due modi.
1) Online. Potete leggere le istruzioni ed eseguirle passo passo al computer con MGL Tools, aiutandovi con le illustrazioni che chiariscono ogni passaggio.
2) In aula informatica con la classe. Se siete insegnanti di chimica, potete adattare la lezione alle esigenze della vostra classe e proporla in aula informatica ai vostri allievi.
La durata di questa lezione è di circa un'ora.
N.B. Cliccando sulle figure potrete vedere le immagini a pieno schermo.

Gli argomenti di questa lezione sono:
-- Legando e sito di legame in una proteina
-- Analisi delle interazioni tra legando e sito di legame

Individuare il legando
Deselezionate la rappresentazione linee (colonna L) per 1uv6_tut e scegliete Ribbon (colonna R).
Colorate la struttura secondaria di 1uv6_tut (colonna Cl) con l'opzione By Chain.
Cliccate sul triangolino azzurro accanto a 1uv6_tut per vedere le subunità di cui è composto (C e D)
Cliccate sul triangolino azzurro accanto alla catena C e scorrete i residui verso il basso fino ad incontrare il legando CCE-1206 (carbammilcolina).
Cliccate su questa e scegliete la rappresentazione con sfere (colonna C) e poi coloratela (colonna Cl) scegliendo cpk e poi By atom type. Otterrete le immagini di figura 3 e figura 4 dove si vede che il legando è contenuto in una tasca formata da due avvolgimenti che sporgono dalla catena C (rosa) e dalla parete beta pieghe della colonna D (ciano).
Per studiare meglio il legando selezionate CCE-1206 e salvatelo come CCE.pdb.
Cliccate col pulsante destro su 1uv6_tut e scegliete Delete per cancellare tutto.
Aprite ora CCE.pdb (che potete anche scaricare da qui).
Scegliete la rappresentazione Balls and Sticks e coloratela con balls, sticks, By atom type.
Aggiungete gli idrogeni con Edit / Hydrogens / Add , OK.
Regolate il valore minimo di fog in Tools intorno a 11, un poco sotto il valore massimo.
Otterrete l'immagine mostrata qui sotto (figura 5).

Come si vede qui sopra in figura 5b, la carbammilcolina è leggermente più polare dell'acetilcolina (ha un NH2 al posto di un CH3) e questo le consente di legarsi con più forza nel sito di legame e di rimanere nella proteina anche durante la cristallizzazione.
Ricordiamo che queste strutture si ottengono dalla diffrazione di raggi X su cristalli di proteine.
Per capire come il legando è alloggiato nella proteina, bisogna individuare e studiare il sito di legame della proteina.

Individuare il sito di legame
Il sito di legame è costituito da tutti gli amminoacidi che circondano il legando.
Chiudete e riaprite MGL Tools.
Aprite 1uv6_tut, selezionate CCE-1206 nella catena C ed eliminatelo con Edit / Delete / Delete Selected Atoms.
Salvate la la proteina senza il legando con il nome 1uv6_pep.
Cancellate 1uv6_tut e aprite 1uv6_pep.
Aprite ora anche CCE.pdb e avrete proteina e legando in due molecole distinte.
Aggiungete gli idrogeni: Edit / Hydrogens / Add.
Lasciate visibili solo gli idrogeni polari: Edit / Hydrogens / Merge Non-Polar.
Rappresentando il legando con Sfere e la proteina con Balls and Sticks si vede che il legando è circondato da una selva di amminoacidi come è mostrato in figura 6.

Selezionate gli amminoacidi del sito di legame con questa procedura:
Selezionate CCE (colonna S)
Premete Select / Spherical Region e, nella finestra di dialogo, aumentate il raggio a 5.5 A, cliccate poi current selection / select / close.
Quindi cliccate Select / Set Selection Level / Residue.
Vedrete gli amminoacidi attorno al legando selezionati con crocette gialle.
Cliccate Select / Invert Selection per invertire la selezione e Edit / Delete / Delete Selected Atoms per eliminare tutti gli amminoacidi più lontani. Otterrete l'immagine di figura 6a.

Selezionate 1uv6_pep e salvate col nome 1uv6_sito, dato che contiene solo gli amminoacidi del sito di legame: 8 amminoacidi della catena C e 7 amminoacidi della catena D..
Potete anche continuare con gli amminoacidi che avete sullo schermo, ma se avrete problemi potete ricaricare 1uv6_sito.
Cliccate Hydrogen Bonds / Build / Set Parms+Build, e si ottengono tre legami idrogeno
quindi cliccate Hydrogen Bonds / Display / As Spheres.
Otterrete l'immagine qui sotto (figura 7).

Il legando è stato rappresentato con Balls and Sticks e reso più visibile colorandolo con l'opzione balls, sticks, Carbon only, Custom color e poi scegliendo il verde chiaro dalla tavolozza.
Osservate che la zona destra del legando, che contiene il gruppo ammonio positivo RN+(CH3)3, è circondata da tre tirosine, due sulla destra e una sopra, (aromatiche, negative a pH neutro) e da due triptofani, in basso e verso di noi, (aromatici, apolari).
Il lato sinistro del legando, che contiene un estere e un'ammide (polare) è circondato da amminoacidi impegnati nei tre legami idrogeno, che formano quindi una zona polare.

Le interazioni legando - sito di legame possono essere analizzate meglio di così usando appositi programmi come AutoDock Vina.
Questi programmi calcolano l'energia dell'interazione legando-proteina mentre cercano di posizionare il legando nel sito di legame nel miglior modo possibile, un'operazione chiamata docking molecolare (docking = mandare in porto).
I programmi di docking molecolare consentono anche di studiare l'interazione con un legando diverso da quello presente nella proteina cristallizzata.
Nella prossima lezione faremo il docking di un farmaco antiinfiammatorio, ibuprofene, nella sua proteina bersaglio, COX2.

Autore: prof Mauro Tonellato

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