Inseguire la luce verde
Anche se a prima vista può sembrare poco importante, la proteina GFP è molto utile alla ricerca scientifica, perché permette di osservare direttamente il funzionamento interno delle cellule viventi. È facile scoprire dove si trova in ogni momento la proteina GFP: basta illuminare con luce ultravioletta, ed ogni proteina GFP emetterà una luce fluorescente verde brillante. Quindi basta legare la proteina GFP ad un oggetto altrimenti invisibile e questo diventerà osservabile. Per esempio, possiamo legarla ad un virus. Poi, quando il virus si diffonde nell'ospite, possiamo seguire questa diffusione osservando il bagliore verde. Oppure, possiamo legarla ad un'altra proteina, e guardare con un microscopio come si muove all'interno della cellula. Recentemente gli scienziati hanno sviluppato un nuovo strumento di questo tipo, gli aptameri di RNA fluorescenti (mdm 1-2019), che permette di osservare nello stesso modo l'RNA.

Costruita già pronta
La proteina GFP è una proteina fluorescente costruita già pronta per funzionare, quindi è particolarmente facile da utilizzare. La maggior parte delle proteine che interagiscono con la luce utilizzano molecole esotiche per catturare e rilasciare fotoni. Per esempio, la rodopsina (mdm 3/2012) nei nostri occhi usa il retinolo per sentire la luce. Questi "cromofori" devono essere costruiti appositamente per svolgere questo compito e poi incorporati con cura nelle proteine. La proteina GFP, invece, ha dentro di sè tutto l'apparato per manipolare la luce, costituito utilizzando solo amminoacidi. Ha una sequenza speciale di tre amminoacidi: treonina-tirosina-glicina (qualche volta, la treonina è sostituita da serina, un amminoacido simile). Quando la catena proteica si avvolge, questo piccolo segmento si trova sepolto in profondità all'interno della proteina. A questo punto avvengono alcune trasformazioni chimiche: la glicina forma un legame chimico con la treonina, formando un nuovo anello chiuso che poi spontaneamente si disidrata. Infine, nel corso di circa un'ora, l'ossigeno dall'ambiente circostante attacca un legame nella tirosina, formando un nuovo doppio legame e creando il cromoforo fluorescente. Dato che la proteina GFP costruisce al suo interno il proprio cromoforo, è perfetta per l'ingegneria genetica. Non bisogna preoccuparsi di manipolare strani cromofori. Basta semplicemente modificare la cellula introducendo le istruzioni genetiche per costruire la proteina GFP, e la GFP si avvolgerà da sola e comincerà a brillare.

Ingegnerizzare la proteina GFP
Gli usi della proteina GFP si stanno moltiplicando anche nel mondo dell'arte e del commercio. L'artista Eduardo Kac ha creato un coniglio verde fluorescente ingegnerizzando la proteina GFP nelle sue cellule. Alcuni ricercatori stanno esplorando la proteina GFP per creare piante e pesci fluorescenti. La proteina GFP è stata aggiunta a ratti, topi, rane, mosche, vermi, e ad altre innumerevoli forme viventi . Naturalmente queste piante e animali ingegnerizzati sono ancora oggetto di controversie, e stanno stimolando un importante dialogo sulla sicurezza e la moralità dell'ingegneria genetica.

Migliorare la proteina GFP
La proteina GFP è molto utile per studiare le cellule viventi, e i ricercatori stanno rendendola ancora più utile. Stanno inserendo con l'ingegneria genetica molecole di proteina GFP che emettono per fluorescenza colori diversi. I ricercatori ora possono fare proteine fluorescenti blu, gialle e di altri colori. Il metodo per riuscirci è introdurre piccole mutazioni che alterano la stabilità del cromoforo. Migliaia di varianti diverse sono già stata sperimentate, e nel PDB se ne possono trovare molte che si sono dimostrate funzionanti.
I ricercatori stanno anche usando la proteina GFP per creare dei biosensori: macchine molecolari che sentono i livelli di ioni o il pH, e poi trasmettono i risultati diventando fluorescenti in modi caratteristici. La molecola mostrata qui a lato (file PDB 1kys) è una proteina fluorescente blu che è stata modificata per sentire il livello di ioni zinco. Quando lo zinco (mostrati in rosso) si lega al cromoforo modificato (blu) la proteina diventa due volte più fluorescente, creando un segnale visibile che può essere facilmente osservato.

Esplorando la struttura
Nella figura qui sotto (file PDB 1ema) potete osservare la proteina GFP con il suo cromoforo. La catena è stata colorata ad arcobaleno, con colori che vanno dal blu (nella parte N-terminale) al rosso (nella parte C-terminale). La struttura della proteina è notevole, ha una forma a barile generata da una disposizione ordinata di tratti beta pieghe che salgono e scendono tutto intorno.
All'interno del barile entra il tratto di catena azzurro che contiene il cromoforo, mostrato in verde, generato dalla fusione di tre amminoacidi della catena: glicina, tirosina, treonina. Il cromoforo si trova proprio nel mezzo del barile, totalmente schermato dall'ambiente circostante. Questa schermatura è essenziale per la fluorescenza. Le molecole d'acqua accalcandosi attorno al cromoforo gli ruberebbero l'energia dopo che questo ha assorbito un fotone. All'interno della proteina, il cromoforo è protetto, e può rilasciare energia emettendo un fotone di luce con energia leggermente inferiore a quella assorbita.



Le due immagini affiancate qui sopra forniscono una visione 3D della proteina se osservate a sguardo incrociato con la seguente procedura.
Mettete le mani a coppa 15 cm davanti ai vostri occhi e lasciate tra i palmi un foro attraverso cui guardare le immagini.
Mantenendo ferma la testa, trovate la posizione delle mani con la quale, guardando solo con l'occhio sinistro, vedete l'immagine di destra e guardando solo col destro, vedete l'immagine di sinistra.
Guardando con entrambi gli occhi, nel foro tra le mani vedrete l'immagine 3D della molecola.
Qui sotto è mostrato il cromoforo in primo piano. Si forma spontaneamente a partire da tre amminoacidi nella catena proteica: treonina (Thr), tirosina (Tyr) e glicina (Gly). Notate che glicina e treonina hanno formato un nuovo legame, indicato dall'asterisco, creando un insolito anello a cinque atomi.

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Bibliografia
Roger Y. Tsien (1998): The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry 67, pp. 509-544.

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