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Molecola del mese di luglio 2004
La DNA ligasi riconnette i filamenti spezzati
del DNA ed è usata per unire filamenti diversi di DNA nell'ingegneria
genetica
. Introduzione
Tutte le cellule umane (con alcune particolari eccezioni)
contengono il patrimonio genetico completo formato da 46 cromosomi, lunghi
filamenti di DNA a doppia elica. Tutte le nostre informazioni genetiche
sono codificate in questi filamenti che sono costituiti da migliaia di
geni incolonnati uno dopo l'altro. La sequenza dei geni e la loro vicinanza
reciproca, possono essere importanti per l'uso corretto delle informazioni
genetiche, quindi è importante che le nostre cellule proteggano
il proprio DNA da ogni possibile rottura accidentale. Se uno dei due filamenti
del DNA si rompe non è un dramma, ma possono sorgere dei problemi
se questo accade quando il DNA a doppia elica è svolto durante
i processi di trascrizione e replicazione. La rottura di entrambi i filamenti,
invece, è molto più pericolosa. Per proteggerci da questi
pericoli, le nostre cellule usano la DNA ligasi, un enzima in grado di
ricucire insieme i filamenti di DNA che sono stati rotti.
Rompere il DNA
Alcune agenti, come i raggi X sono pericolosi e possono
danneggiare il DNA, ma talvolta sono le nostre stesse cellule che rompono
intenzionalmente il DNA.
Le radiazioni ionizzanti, come i raggi gamma e i raggi x, attaccano
la catena del DNA e la spezzano in più punti.
L'ossigeno, al quale le nostre cellule sono continuamente esposte,
è un gas pericoloso che può formare radicali liberi molto
reattivi che attaccano il DNA.
In casi particolari alcune cellule spezzano intenzionalmente il proprio
DNA.
Durante la meiosi, il processo nel quale il genoma è diviso
in due metà per la creazione di cellule uovo o di spermatozoi,
il DNA viene anche ricombinato con una operazione chiamata crossing
over. Porzioni di un filamento di DNA sono tagliate e scambiate con
porzioni simili prelevate dal cromosoma omologo.
Le cellule del sistema immunitario rimescolano i loro filamenti
di DNA, tagliando dei frammenti da una posizione per introdurli in una
posizione diversa e ottenere così un nuovo insieme di geni anticorpali.
Interruzioni in un filamento di DNA vengono anche create durante la replicazione.
La DNA polimerasi può lavorare solo in direzione 5'-3'quando copia
un filamento di DNA, così solo uno dei due filamenti della doppia
elica viene copiato in modo continuo, mentre l'altro viene copiato in
una serie di piccoli pezzi (frammenti di Okazaki) che hanno bisogno di
essere collegati insieme dalla DNA ligasi per formare un filamento continuo.
Riparare il DNA spezzato
La DNA ligasi è in grado di ricucire i due
frammenti di una catena di DNA che è stata spezzata. Per compiere
la reazione usa come coenzima ATP, in alcuni casi, o NAD+
in altri, ed inoltre usa un particolare amminoacido di lisina.
La DNA ligasi del batteriofago T7, mostrata qui sopra (file PDB
1a0i) e quella umana usano entrambe
ATP.
Il loro sito attivo è mostrato nelle due immagini qui sotto,
a sinistra vi è quello della DNA ligasi di batteriofago T7, a
destra è mostrato il sito attivo della DNA ligasi umana (file
PDB 3w5o). In entrambe le immagini sono
evidenziati ATP (sfere colorate), la lisina che partecipa alla reazione
(azzurra) e altre due lisine (rosa) che aiutano la reazione. Notate
l'incredibile somiglianza tra i siti attivi di questi due enzimi.
Molti batteri, invece di ATP, usano NAD+
nella reazione, come la DNA ligasi mostrata qui sotto (file PDB 1dgs).
In entrambi i casi, una lisina nella DNA ligasi (azzurra) forma un legame
col fosfato del cofattore, legandosi con la porzione di AMP, adenosinamonofosfato,
e scartando il resto. Più tardi, nella reazione, questo AMP viene
prima trasferito al filamento di DNA rotto, e poi rilasciato quando
il filamento è ricucito.
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Manipolare i geni
La DNA ligasi è un enzima estremamente utile,
sia nelle cellule che in laboratorio. Insieme con gli enzimi
di restrizione (mdm 8-2000), ha reso possibile lo sviluppo della
tecnologia del DNA ricombinante. Con questi due enzimi, i ricercatori
possono tagliare e ricucire a piacimento i filamenti di DNA, realizzando
nuovi geni e nuovi genomi. Gli enzimi di restrizione sono come forbici,
che permettono di tagliare il DNA in punti specifici. La DNA ligasi
permette poi di riconnetterli per ottenere filamenti di DNA funzionanti.
Con questa tecnologia, siamo in grado di fare in laboratorio quello
che le cellule hanno fatto per miliardi di anni!
 Congiunzione
non-omologa
Un'altra reazione importante compiuta dalla DNA
ligasi è la congiunzione non-omologa. Si verifica quando entrambi
i filamenti del DNA si rompono, e la cellula deve incollarli di nuovo
insieme. È un sistema di riparazione d'emergenza, quindi
può introdurre uno o due errori nelle informazioni genetiche
mentre le due terminazioni vengono preparate per essere riunite, ma
questo è certamente meglio che lasciare il DNA spezzato.
Alcune delle molecole coinvolte nel processo sono mostrate qui a lato.
Si ritiene che la proteina Ku (file PDB 1jey)
ed una proteina chinasi DNA dipendente (non mostrata) avvicinino le
due terminazioni e le tengano ferme nella giusta posizione. Notate che
le due subunità di Ku hanno dei bracci che si avvolgono attorno
ai filamenti di DNA. La DNA ligasi, aiutata dalla proteina Xrcc4 (file
PDB 1ik9), ricuce insieme i filamenti.
La DNA ligasi è mostrata in modo schematico, perchè la
struttura atomica della forma umana nel 2004 non era stata ancora risolta.
La DNA ligasi umana vista sopra (file PDB 3w5o)
è stata determinata nel 2013.
Esplorando la struttura
Nella figura qui sotto di DNA ligasi di Clorella
virus (file PDB 1fvi) si può vedere in
dettaglio la molecola di AMP attivata che viene usata nella reazione
di ricucitura. La DNA ligasi di Clorella virus è una versione
più piccola di quella che si trova nelle nostre cellule. La Lisina
27 (azzurra) forma un legame covalente col fosfato dell'AMP, e così
lo prepara per la reazione di ricucitura. Il DNA si legherà nel
grande incavo in alto.
 Bibliografia
A. J. Doherty and S. W. Suh (2000) Structural and Mechanistic
Conservation in DNA Ligases. Nucleic Acids Research 28,
4051-4058.
D. C. van Gent, J. H. J. Hoeijmakers and R. Kanaar (2001)
Chromosomal Stability and the DNA Double-stranded Break Connection.
Nature Reviews Genetics 2, 196-206.
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