Introduzione
Lo zucchero ha un buon sapore ed è ovvio perché il glucosio è la principale fonte di energia per tutti gli organismi aerobi. Lo zucchero viene demolito nella via metabolica principale chiamata respirazione cellulare che comprende glicolisi (mdm 2/2004) , decarbossilazione ossidativa (mdm 9/2012) e ciclo di Krebs (mdm10-2012) e alla fine porta alla sintesi di ATP. Gli enzimi di questo percorso biochimico spezzano la catena di carboni del glucosio producendo CO2 e catturano l'energia liberata in ogni passaggio. L'enzima isocitrato deidrogenasi realizza la terza reazione del ciclo di Krebs nella quale rilascia una molecola di CO2 in seguito all'ossidazione e alla decarbossilazione dell'acido isocitrico. Nella reazione vengono rimossi due idrogeni, il primo è uno ione idruro H- che, durante l'ossidazione, viene trasferito al NAD+ e lo trasforma in NADH che servirà poi per azionare, attraverso la catena respiratoria (mdm 12/2011), la produzione di ATP da parte dell'enzima ATP sintasi (mdm 12/2005). L'altro idrogeno viene rimosso come H+ durante la decarbossilazione.

Approcci diversi per lo stesso compito
Nelle nostre cellule, così come in quelle di tutti gli eucarioti, queste reazioni sono realizzate da un enzima complesso, composto di otto catene proteiche.
Qui a lato in alto è mostrato l'enzima di lievito (file PDB 3blw). L'enzima è composto di quattro catene catalitiche (azzurre) che realizzano le reazioni, e quattro catene regolatorie (blu) che accendono o spengono l'enzima a seconda dei livelli di ADP e ATP nella cellula.
I batteri (procarioti) usano una diversa strategia. Utilizzano un enzima più semplice composto di due sole catene proteiche identiche che contengono due siti attivi uguali, come è illustrato qui sopra in basso (file PDB 9icd).
Anche le nostre cellule possiedono una versione piccola dell'enzima isocitrato deidrogenasi, ma lo usano nel citoplasma per interconvertire isocitrato e alfa-chetoglutarato quando servono per altri scopi sintetici (il ciclo di Krebs, invece, è localizzato nei mitocondri).

Controllo con la fosforilazione
L'enzima batterico isocitrato deidrogenasi non è controllato dai livelli di ADP e ATP come il nostro enzima che lavora nei mitocondri. Dato però che anche i batteri devono poter spegnere l'enzima quando c'è abbastanza ATP, regolano l'enzima isocitrato deidrogenasi aggiungendo un fosfato alla catena proteica per inattivarlo. Per questa fosforilazione usano l'enzima isocitrato deidrogenasi chinasi/fosfatasi che è mostrato qui a lato in arancione (file PDB 3lcb) mentre è legato all'isocitrato deidrogenasi (azzurro). Questo enzima è in grado di realizzare entrambe le reazioni: aggiunge fosfato per spegnere l'enzima e lo rimuove per attivarlo. Questo enzima regolatore decide quale reazione è meglio effettuare a seconda dei livelli di AMP nella cellula: quando i livelli sono alti, AMP si lega ad un sito di regolazione attivando la reazione di rimozione del fosfato, questo porta all'attivazione del ciclo di Krebs e quindi alla sintesi di ATP. Bassi livelli di AMP, invece, lo fanno diventare una chinasi cioè un enzima che aggiunge fosfato.

Esplorando la struttura
I cristallografi hanno esplorato molti degli stadi della reazione condotta dall'enzima isocitrato deidrogenasi. Le prime strutture ottenute mostravano i complessi che l'enzima realizza con i suoi vari substrati e con i prodotti di reazione. Negli archivi PDB ci sono quindi strutture dell'enzima con isocitrato e magnesio (file PDB 8icd), NADP (file PDB 9icd), alfa-chetoglutarato (file PDB 1ika), e inoltre l'apoenzima (enzima nudo, file PDB 3icd), e l'enzima fosforilato inattivo (file PDB 4icd).
Per studiare i dettagli della reazione, però, è stato necessario ricorrere a speciali tecniche sperimentali.
Sincronizzando con precisione l'addizione di substrato a forme mutate dell'enzima e poi utilizzando la tecnica di diffrazione Laue per ottenere dati cristallografici in millisecondi, i ricercatori sono stati in grado di osservare gli intermedi instabili della reazione.
Qui sotto è mostrato l'enzima mutante Y160F (file PDB 1ide) che rallenta molto il primo stadio della reazione, rivelando così la struttura del complesso appena formato tra l'enzima, l'isocitrato, il NADP e il magnesio, prima che la reazione di ossidazione abbia inizio.
Nell'isocitrato (piccole sfere azzurre) il carbonio che regge l'OH (con asterisco) è circondato in basso dallo ione magnesio (verde) e in alto dalla porzione ossidante del NADP+ (con asterisco). Questo è il momento in cui l'socitrato cede lo ione H- al NADP+. La reazione è rallentata perchè una tirosina critica nel sito attivo (Tyr 160) è stata sostituita con una fenilalanina (rosa).

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Qui sotto è mostrato l'enzima mutante K230M (file PDB 1idc) che, invece, rallenta il secondo stadio della reazione, rivelando così la struttura dell'enzima legato all'intermedio ossalacetato prima che avvenga la decarbossilazione e cioè la perdita di CO2. Si osservi che l'isocitrato ossidato è diventato acido ossalosuccinico (piccole sfere azzurre) . E' circondato oltre che dal magnesio (verde) che si lega all'ossigeno del carbonile (rosso al centro), anche da una tirosina (Tyr 160, rosa) che con il suo ossigeno (rosso) sta per strappare l'H+ al carbossile centrale dell'acido ossalosuccinico . Questo, poi, si staccherà come CO2 formando alfa-chetoglutarato, il prodotto finale.

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Spunti per ulteriori esplorazioni
Negli archivi PDB sono disponibili le strutture di molti degli otto enzimi del ciclo di Krebs. Provate a trovarle.
L'enzima isocitrato deidrogenasi sa distinguere tra i due stereoisomeri dell'isocitrato. Riesce a farlo perchè circonda l'isocitrato e forma specifiche interazioni con ognuno dei suoi gruppi funzionali. Provate ad identificare gli amminoacidi nella catena proteica dell'enzima che sono importanti per queste interazioni. Cercate anche di capire il ruolo dello ione magnesio.

Bibliografia
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