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Ossido nitrico sintasi |
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Molecola del Mese di Gennaio 2011 L'ossido nitrico è un vasodilatatore o un neurotrasmettitore, ma anche, ad alta concentrazione, una sostanza tossica di difesa  IntroduzioneLa nitroglicerina, mostrata qui a fianco, è un potente esplosivo che scoppia quando è sottoposto a pressione o riscaldamento. La stessa molecola, però, è un farmaco salva-vita in caso di infarto. Una piccola dose di nitroglicerina messa sotto la lingua si decompone lentamente liberando ossido nitrico (NO) (mostrato qui sotto) che poi diffonde fino alle cellule muscolari che circondano i vasi sanguigni e ne provoca il rilassamento. Questo produce una vasodilatazione che migliora il flusso sanguigno. Le proprietà terapeutiche della nitroglicerina sono note da più di un secolo, ma solo recentemente gli scienziati hanno scoperto il suo meccanismo d'azione mediato dall'ossido nitrico.  NO problem L'ossido nitrico è un gas incolore molto reattivo perche è un radicale libero, la sua molecola (NO) è formata da un atomo di azoto legato ad un atomo di ossigeno (figura qui sopra). Nel nostro corpo viene usato per due scopi diversi, per trasmettere un segnale o come sostanza tossica di difesa. L'ossido nitrico che agisce da messaggero viene prodotto in continuazione a bassi livelli e controlla la contrazione delle cellule muscolari e la crescita delle cellule nervose. L'ossido nitrico è particolarmente efficace come messaggero infatti diffonde rapidamente dato che la sua molecola è molto piccola e apolare, ma rimane abbastanza localizzato perché è molto reattivo e viene distrutto in breve tempo. L'ossido nitrico può anche agire come sostanza tossica grazie alla sua grande reattività. I macrofagi, cellule del sistema immunitario, lo utilizzano per uccidere i patogeni insieme con altri composti reattivi dell'ossigeno come l'acqua ossigenata.  NOS
Nelle cellule animali ci sono tre enzimi che producono ossido nitrico per le diverse funzioni, e sono chiamati ossido nitrico sintasi (NOS) neuronale, endoteliale e inducibile.. La NOS neuronale (mostrata qui a fianco) e la NOS endoteliale producono continuamente NO a bassa concentrazione che agisce rispettivamente come neurotrasmettitore e come vasodilatatore. La NOS inducibile produce maggiori quantità di NO che risultano tossiche e servono per combattere i patogeni. Tutti e tre questi enzimi sono complessi e sono formati da molte subunità che svolgono funzioni diverse. I ricercatori sono riusciti a determinarne la struttura solo scomponendoli nelle singole parti. La subunità che si trova in alto (subunità ossidante) produce NO con l'aiuto di un gruppo eme (rosa) che aggiunge un atomo di ossigeno, proveniente da O2, all'azoto in catena laterale di un amminoacido di arginina (in giallo) che viene trasformata in citrullina. Questa è stata la prima subunità ad essere studiata con la cristallografia ed è stata determinata dapprima su una NOS inducibile (file PDB 1nod) e in un secondo momento su una NOS neuronale come quella mostrata qui a fianco (file PDB 1om4). La subunità in basso (file PDB 1tll) (subunità riducente) dona elettroni a quella in alto e contiene coenzimi riducenti come NADPH, FAD, FMN (magenta). Il breve segmento che unisce le due subunità (azzurro) è legato alla calmodulina (mdm 8-2003, verde) (file PDB 2o60) che controlla il flusso di elettroni. 
Dire NONel caso della NOS endoteliale (vasodilatatrice), il messaggio portato da NO è ricevuto dall'enzima guanilato ciclasi solubile (mostrato qui a fianco), un enzima complesso che inizia una catena di eventi a cascata all'interno della cellula. Quando si lega ad una molecola di NO, l'enzima si attiva e trasforma GTP in GTP ciclico (cGTP). Questa molecola agisce come secondo messaggero attivando delle chinasi che a loro volta fosforilano la miosina provocando il rilassamento delle cellule muscolari. Come NOS, anche la guanilato ciclasi solubile è un enzima complesso formato da molti domini che è stato studiato per parti dai cristallografi. La porzione che lega NO è mostrata in alto (file PDB 2o0c) dove si vede un gruppo eme (rosa) che lega l'ossido nitrico (azzurro e rosso al centro dell'eme). La porzione ciclasi è mostrata in basso (file PDB 3et6) e vi sono poi altri domini che legano queste due parti (file PDB 3hls e 2p04). Nella figura qui sotto è mostrato in dettaglio il legame tra NO ed eme. L'ossido nitrico (azoto blu e ossigeno rosso) si lega obliquamente sopra l'atomo di ferro (marrone) che si trova al centro dell'eme. Notate che il ferro dell'eme si lega in basso all'anello di una istidina.  Esplorando la struttura Le tre isoforme di NOS sono molto simili e quindi i ricercatori stanno cercando di sfruttare alcune piccole differenze per creare un farmaco che ne blocchi una senza influenzare le altre due. Questo sarà molto utile per curare alcune malattie. Per esempio, la iNOS, ossido nitrico sintasi inducibile, ha un ruolo chiave nello sviluppo del morbo di Parkinson e in quello di Alzheimer e anche nella sclerosi multipla, quindi farmaci in grado di bloccare la iNOS, ma non le altre due, potrebbero aiutare nel trattamento di queste malattie. Purtroppo, però, i siti attivi delle tre isoforme di NOS sono praticamente identici e quindi i ricercatori stanno sintetizzando dei farmaci più grandi che arrivino ad interagire anche con altri punti dell'enzima dove si manifesta una differenza. Nelle due figure qui sotto potete vedere a sinistra il normale sito catalitico di una NOS neuronale (file PDB 1om4) che contiene una molecola di arginina (rosa) che ha gli atomi di azoto (blu) sopra il ferro al centro dell'eme dove sta per arrivare una molecola di O2 per la sintesi di NO. Qui sotto a destra è mostrato il sito attivo quasi identico di una NOS inducibile (file PDB 3e7t) con un farmaco inibitore (rosa) che ha occupato lo spazio normalmente destinato all'arginina e quindi impedisce la sintesi di NO. Notate che, in entrambe le NOS, il ferro dell'eme è ancorato alla proteina dal legame in basso con lo zolfo (giallo) di una cisteina. 
 Spunti per ulteriori esplorazioni 1. L'enzima ossido nitrico sintasi è presente anche in alcuni batteri. Confrontate le strutture degli enzimi batterici con quelli di mammifero usando lo strumento "Structure Comparison" nel sito PDB 2. Negli archivi PDB si trovano le strutture di molti farmaci sperimentali legati al sito attivo di NOS. Usate lo strumento "Ligand Explorer" per esaminare le interazioni di questi farmaci con l'enzima e con cofattori nell'enzima.  BibliografiaS. Daff (2010) NO synthase: structures and mechanisms. Nitric Oxide 23, 1-11. B. R. Crane, J. Sudhamsu and B. A. Patel (2010) Bacterial nitric oxide synthases. Annual Review of Biochemistry 79, 445-470. C. Villanueva, C. Giulivi (2010) Subcellular and cellular locations of nitric oxide synthase isoforms as determinants of health and disease. Free Radical Biology and Medicine 49, 307-316. E. D. Garcin, A. S. Arvai, R. J. Rosenfeld, M. D. Kroeger, B. R. Crane, G. Andersson, G. Andrews, P. J. Hamley, P. R. Mallinder, D. J. Nicholls, S. A. St-Gallay, A. C. Tinker, N. P. Gensmantel, A. Mete, D. R. Cheshire, S. Connolly, D. J. Stuehr, S. Aberg, A. V. Wallace, J. A. Tainer and E. D. Getzoff (2009) Anchored plasticity opens doors for selective inhibitor design in nitric oxide synthase. Nature Chemical Biology 4, 700-707.
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