Introduzione
Talvolta la modifica di un singolo amminoacido in una proteina può avere conseguenze drammatiche. Queste modifiche o mutazioni possono essere causate anche dalla variazione di un solo nucleotide di un gene che viene chiamata variante a singolo nucleotide o SNV.
Le SNV cambiano il significato di una tripletta del gene e quindi cambiano l'amminoacido codificato in quella posizione.
Per esempio il cambiamento nel gene di una Guanina con una Timina trasforma la tripletta GGC in GTC.
La prima codifica per Glicina, mentre la seconda codifica per Valina.
In questo modo vengono sintetizzate proteine mutanti.
Un esempio perfetto di questo tipo si trova nel gene che codifica per la proteina di segnalazione BRAF: un cambiamento di un singolo nucleotide può trasformare una cellula normale in una cellula di melanoma.





Mandare il segnale
La proteina RAF (in azzurro nella figura qui sopra) ha un ruolo importante nel controllare la crescita cellulare. Il processo di segnalazione comincia quando viene attivato un recettore, come quello dell'ormone della crescita (mdm 4-2004, non mostrato qui sopra). Il segnale da questo è trasmesso ad una serie di proteine che operano in cascata all'interno della cellula: da RAS (mdm 4-2012, rossa), a RAF (azzurra), a MEK (magenta) e infine a ERK che si muove nella cellula per innescare i meccanismi cellulari di crescita. Molte di queste proteine sono chinasi che aggiungono gruppi fosfato alla superficie della successiva proteina della catena, per attivarla.

Da RAS a RAF
La proteina RAF (azzurra qui sopra), è una molecola complessa con molti domini che svolgono diverse funzioni. Finora i biochimici strutturali hanno studiato molti di questi domini. Il dominio di RAF che lega la proteina RAS (rossa, file PDB 3kud) si lega a questa solo se è attivata cioè se è legata a GTP. Dato che molte copie di RAS sono legate alla superficie interna della membrana cellulare, costringono le proteine RAF legate ad avvicinarsi tra loro, favorendone la dimerizzazione, questo è il segnale di attivazione per RAF.
Un altro dominio di RAF, chiamato dominio ricco di cisteine (azzurro in alto al centro nella figura in alto, file PDB 1far), aiuta la dimerizzazione interagendo con la superficie interna della membrana cellulare.

Da RAF a MEK
Il dimero di RAF è attivato, quindi a sua volta attiva MEK (magenta) fosforilandola. Questo processo è stato catturato dalla struttura PDB 4mne, ed è mostrato nella figura qui sopra in basso dove si vede il dimero di RAF al centro con due copie di MEK legate ai lati.
Alcuni filamenti flessibili (schematizzati con segmenti azzurri) legano tra loro le varie porzioni di RAF.
Nelle nostre cellule si trovano molte forme di RAF chiamate ARAF, BRAF, CRAF che lavorano insieme formando spesso dei dimeri misti nei quali si legano insieme due forme diverse, in questo modo possiamo controllare i molteplici aspetti della crescita cellulare.

Mutazione oncogenica
Un piccolo segmento di BRAF, mostrato in rosa nella figura qui a fianco (file PDB 1uwh), è chiamato segmento di attivazione perchè è il punto chiave per la segnalazione. Questo tratto è normalmente fosforilato in più punti quando la proteina è attivata e la costringe a mantenere l'assetto tridimensionale attivo. Un particolare amminoacido in questo segmento (nella posizione 600) è il sito della mutazione oncogenica. Quando in questo punto al posto di una valina si trova acido glutammico (chiamata mutazione V600E: V = valina, E = acido glutammico), la parte restante del segmento si sposta e rende l'enzima sempre attivo. Questo cambiamento strutturale consente alle cellule cancerose di crescere eludendo i normali controlli. Questa mutazione è la conseguenza di una SNV (mutazione a singolo nucleotide) nel gene che codifica RAF. Questa mutazione si trova solo nelle cellule maligne, mentre è assente nei tessuti normali dello stesso individuo.
Negli Stati Uniti la FDA (Food and Drug Administration) ha approvato il farmaco Vermurafenib che era stato progettato in modo specifico per combattere la forma mutante V600E della proteina RAF che si trova nella metà dei melanomi maligni, una forma mortale di cancro della pelle. L'uso del Vermurafenib è limitato ai soli pazienti che hanno un melanoma con la mutazione V600E che può essere individuata da un test diagnostico sviluppato insieme al farmaco.

Esplorando la struttura
La conoscenza della struttura mutata di RAF ha permesso ai ricercatori di progettare un farmaco in grado di bloccarne l'azione frenando così la crescita innaturale delle cellule cancerose. Questi farmaci sono efficaci su alcuni tipi di tumore, come il melanoma, ma possono risultare controproducenti in altri tipi di tumore accelerandone la crescita. Quando i ricercatori hanno studiato più a fondo questo aspetto, hanno scoperto che la crescita inattesa poteva essere causata da una interazione insolita: talvolta BRAF e CRAF formano eterodimeri, ma il farmaco si lega solo a BRAF. Questo problema è stato superato usando dosi più alte del farmaco per bloccare tutte e due le forme, ma ora stanno lavorando su un farmaco di seconda generazione capace di impedire a RAF di formare dimeri e quindi di attivarsi.
Nelle due figure qui sotto sono mostrate proteine RAF legate a tre diversi farmaci:
nella figura di sinistra potete vedere alternativamente Vemurafenib (file PDB 3og7) e Dabrafenib (file PDB 4xv2)
nella figura a destra potete vedere alternativamente Dabrafenib (file PDB 4xv2) e il farmaco sperimentale PLX7904 (file PDB 4xv1).
Passando con la freccia del mouse sulle figure, vedrete alternativamente i due farmaci indicati.

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Spunti per ulteriori esplorazioni
Potete usare lo strumento "Protein Feature View" per BRAF per scoprire se le strutture dei domini di RAF corrispondono alla struttura di altre proteine
Molti dei farmaci che attaccano la proteina RAF sono stati progettati per imitare la struttura di ATP, dato che ATP è essenziale nella reazione di fosforilazione. Cercate di identificare le porzioni dei farmaci che imitano la base azotata di ATP o il gruppo fosfato

Bibliografia
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