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Adenina Riboswitch |
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Molecola del Mese di Giugno 2017 La cristallografia XFEL ha rivelato cosa accade quando una adenina si lega al suo riboswitch  Introduzione
I riboswitch (mdm 10-2010) sono elementi regolatori inseriti diretta-mente nell'RNA messaggero. Come dice il nome, si comportano da interruttori che accendono o spengono l'azione dell'RNA messaggero quando si legano ad uno specifico legando, in questo caso adenina. I riboswitch hanno due domini: un dominio che cambia di conformazione quando si lega ad uno specifico legando ed un secondo dominio detto piattaforma di espressione che controlla l'espressione dell'RNA messaggero. Quando il riboswitch contiene al suo interno il legando (mostrato in verde qui a fianco sulla destra), assume la conformazione ripiegata (interruttore spento) che impedisce la sintesi proteica. Quando invece il legando non è disponibile, il riboswitch si trova nella conformazione rilassata (interruttore acceso, sulla sinistra) e permette la sintesi di proteine. Le strutture degli aptameri sono difficili da osservare con la normale cristallografia a raggi X, a causa dei movimenti della struttura provocati dall'interazione col legando. Nei normali cristalli le molecole congelano in una sola struttura così gli aptameri liberi risultano molto simili agli aptameri che contengono il legando. I ricercatori, per risolvere questo problema, hanno usato micro- e nano cristalli illuminati con sorgenti di radiazioni XFEL e così hanno potuto osservare nel dettaglio cosa accade quando il legando si lega all'aptamero. Laser ad elettroni liberi I laser ad elettroni liberi (FEL Free Electron Laser) producono impulsi di raggi X molto forti, ma molto brevi, dell'ordine del femtosecondo (10-15 s). Negli esperimenti XFEL, un flusso di micro- e nano cristalli viene investito da lampi di raggi X. Ogni volta che un cristallo è colpito, produce uno spettro di diffrazione istantaneo che corrisponde alla molecola presente in quel cristallo in quel momento. Anche se i cristalli si presentano al laser con orientazioni casuali, i ricercatori individuano i tracciati simili e costruicono un set completo di dati di diffrazione. Mescola ed inietta Per catturare i cambiamenti di struttura delle molecole, i ricercatori raccolgono tracciati di diffrazione in momenti prestabiliti durante una reazione. Negli studi sulla proteina gialla fotoattiva (mdm 3-2017) i ricercatori hanno illuminato la proteina con la luce e hanno osservato le variazioni di struttura che si producevano. Nel caso dei riboswitch i ricercatori hanno aggiunto una specifica molecola di segnalazione, in questo caso adenina. Nell'immagine qui sopra, sono mostrate due delle strutture raccolte. La prima mostra il riboswitch senza adenina (file PDB 5e54). Per ottenere la seconda i ricercatori hanno mescolato adenina (in verde) ai cristalli e, dopo circa 10 minuti, hanno raccolto i dati XFEL. (PDB entry 5swe).  Cristalli
mobiliI cristalli delle biomolecole spesso hanno un film di solvente attorno alle molecole e quindi i legandi possono essere fatti penetrare nei cristalli per esplorare come vengono legati. Purtroppo questi cambiamenti non si possono osservare con la cristallo-grafia classica perchè i raggi X di sincrotrone richiedono cristalli grandi che si rompono quando si aggiunge il legando. Questo studio sui riboswitch, però, dimostra che i micro- e i nanocristalli, usati con la tecnica XFEL, sopportano senza rompersi l'aggiunta del legando e consentono alle macromolecole che contengono di eseguire grandi movimenti.. Qui a fianco sono mostrate le strutture cristalline delle forme libera (sopra) e legata (sotto). Notate che il grande cambiamento di forma degli aptameri ha forzato le catene ad allontanarsi tra loro producendo una struttura molto diversa.  Esplorando
la strutturaDurante l'analisi con la tecnica XFEL delle strutture che si formano dopo l'addizione di adenina al riboswitch, i ricercatori hanno osservato una cosa interessante: dopo circa 10 secondi di reazione si forma uno stato intermedio (mostrato qui a fianco, file PDB 5swd) nel quale l'adenina è legata nella tasca di legame, ma la struttura del riboswitch è ancora quella iniziale, rilassata. Solo in seguito si produce il ripiegamento che fa avvicinare le due regioni chiamate stem (asse, mostrata in rosso) e latch (chiavistello, mostrata in giallo) per generare la conformazione finale legata inattiva. Qui sotto potete vedere una animazione 3D che mostra in sequenza le tre strutture: libera (tempo 0), intermedia (dopo 10 secondi) e legata (dopo 10 minuti). Le due immagini affiancate forniscono una visione 3D se osservate in modo incrociato con la seguente procedura. Mettete le mani a coppa 20 cm davanti agli occhi e lasciate tra i palmi un foro attraverso cui guardare le immagini. Trovate la posizione delle mani con la quale, senza muovere il foro tra le mani, con l'occhio sinistro vedete solo l'immagine di destra e poi col destro solo quella di sinistra. Guardate con entrambi gli occhi, nel foro tra le vostre mani vedrete l'immagine 3D della molecola. 
Spunti per ulteriori approfondimenti XFEL è una tecnica nuova, ma ci sono già molte strutture negli archivi PDB ottenute in questo modo. Provate a cercare "XFEL" nella pagina PDB per vederne alcune. Negli archivi PDB ci sono le strutture di decine di riboswitch, fate una ricerca per "riboswitch" per esaminarne alcune.  BibliografiaCP Jones, AR Ferré-D’Amaré (2017) Long-range interactions in riboswitch control of gene expression. Annual Review of Biophysics 46, 455-481. 5e54, 5swd, 5swe. JR Stagno, Y Liu, YR Bhandari, CE Conrad, S Panja, M Swain, L Fan, G Nelson, C Li, DR Wendel, TA White, JD Coe, MO Wiedorn, J Knoska, D Oberthuer, RA Tuckey, P Yu, M Dyba, SG Tarasov, U Weierstall, TD Grant, CD Schwieters, J Zhang, AR Ferré-D’Amaré, P Fromme, DE Draper, M Liang, MS Hunter, S Boutet, K Tan, X Zuo, X Ji, A Barty, NA Zatsepin, H N Chapman, JCH Spence, SA Woodson & YX Wang (2017) Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature 541, 242-246.
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