Pianeta
Chimica.it
Responsabile:
Prof. Mauro Tonellato
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MODELLISTICA
MOLECOLARE
Docking Molecolare
con AutoDock Vina
PROGETTARE
NUOVI FARMACI
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Chimica al computer con
MGL Tools e AutoDock
Struttura delle Proteine
Proteine e Legandi
Docking su COX2
Progettare nuovi farmaci
Chimica al computer con
ArgusLab
1-butene
e 2-butene
Carbocatione
1° e 2°
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e tautomeria
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coniugati (pdf)
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e aromaticità (pdf)
Legame covalente
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Ponte Cloronio
Diels-Alder
Enolo
Mono e Disostituito (pdf)
Chimica al Computer
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Docking Molecolare significa letteralmente mandare in porto
una molecola, si tratta di una simulazione al computer che calcola
la posizione più conveniente che un legando (una piccola
molecola organica) può assumere all'interno del sito attivo di
un enzima. Se il legando non è quello naturale dell'enzima, si
comporta come un inibitore competitivo e blocca temporaneamente
l'attività dell'enzima. Questa tecnica è utilizzata per
progettare al computer nuovi farmaci.
Uno dei programmi più usati per fare Docking
Molecolare è AutoDock
Vina (gratuito, open source, creato dal Dr. Oleg Trott del The
Scripps Research Institute) che ha raggiunto la velocità e l'affidabilità
di altri costosi programmi commerciali. Quello che segue è un
AutoDock Vina tutorial.
Per fare docking molecolare con AutoDock Vina non servono attrezzature
professionali, basta un normale PC e seguire la procedura mostrata qui
sotto.
Se siete insegnanti di chimica, potreste proporre ai vostri studenti
un'esperienza pratica di docking molecolare nel laboratorio di informatica
della scuola.
I software da scaricare sono i seguenti:
MGL Tools http://mgltools.scripps.edu/downloads
(prepara proteina e legando e valuta i risultati)
AutoDock Vina http://vina.scripps.edu/download.html
(esegue il docking molecolare)
Avogadro http://avogadro.cc/wiki/Main_Page
(crea nuove molecole da usare come legandi)
COX2, cicloossigenasi 2, è l'enzima
che trasforma l'acido arachidonico in prostaglandina, un mediatore del
dolore e dell'infiammazione. COX2 è il bersaglio dei FANS, farmaci
antiinfiammatori non steroidei, tra i quali, i più famosi sono
aspirina e ibuprofene.
Celecoxib è un farmaco antiinfiammatorio di nuova generazione.
In questo secondo AutoDock Vina tutorial cercheremo di capire
come si progettano nuovi farmaci.
Cominceremo esaminando i risultati del docking
di celecoxib all'interno dell'enzima COX2 fatto
nella lezione precedente.
Useremo Avogadro per creare nuove molecole da sottoporre al docking
Faremo il docking molecolare su COX2 di tutti i farmaci creati
Esamineremo i risultati dei docking per valutare la bontà
dei nuovi farmaci
Questa lezione è stata preparata con la collaborazione di due
allievi di 4i che, nel laboratorio di informatica della scuola, hanno
fatto decine di docking di molecole che loro stessi hanno progettato
e realizzato con Avogadro:
Marco Benin e Filippo Pescarolo (4i, anno scolastico 2016-2017)
N.B. Cliccando sulle immagini qui sotto potrete vederle ingrandite.
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figura 1
figura 2
figura 3
figura 4
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Software necessario
=> Assicuratevi di aver installato i tre programmi.AutoDock_Vina,
MglTools, Avogadro.
=> Copiate in C:\ la directory COX2N
che sarà la directory di lavolo di questa lezione: contiene la
proteina 3LN.pdbqt, il legando CEL.pdb, il file config_3LN_CEL.txt,
il docking di celecoxib, 3LN_CEL_vina.pdbqt, e gli amminoacidi
AA.pdb che circondano il legando nella tasca di legame.
=> Naturalmente dovete aver già svolto la lezione precedente
Docking_su_COX2 perchè
molte procedure saranno date per scontate.
Ottimizzare CEL con Avogadro
Per rendere più credibile il confronto
tra i vari farmaci, conviene che tutte le molecole da sottoporre al
docking siano ottimizzate nello stesso modo, con Avogadro.
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
1) Ottimizzate
CEL.pdb con Avogadro
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Aprite con Avogadro il file CEL.pdb che si trova in COX2N
---
> > > Aggiungete gli idrogeni ---
Build => Add hydrogens => ok
> > > Ottimizzate la geometria ---
Cliccate su E (auto optimzation tool) => nel campo
Force Field scegliete MMFF94S => start
Quando il programma ha raggiunto un minimo di energia (dE < 10-8
kJ/mol) l'operazione si arresta.
In questo caso l'energia ottenuta è E = 251.266 kJ/mol (Fig.1).
Cliccate stop per disattivare la ricerca del minimo di energia.
> > > Salvate il legando ottimizzato
col nome CELA.pdb in COX2N ---
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
2) Correggete
il nome del legando all'interno del file pdb usando la sigla
LIG 1 di Avogadro
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
Aprite CELA.pdb con notepad e osservate che ogni atomo è descritto
da una riga di dati (Fig.2)
Sostituite su tutti gli atomi il nome del legando "CEL A 682"
con la sigla standard di Avogadro: "LIG 1".
Fate attenzione: la nuova stringa deve iniziare e finire esattamente
dove inizia e finisce la vecchia in modo da non alterare le altre colonne
di numeri:
scrivete LIG sopra CEL, poi, dopo 5 spazi vuoti, scrivete 1 sopra il
2 finale come si vede nella figura seguente (Fig.3).
Usate la funzione copia/incolla per fare più in fretta (Ctrl
C / Ctrl V)
> > > Salvate il legando ottimizzato e corretto col nome CELAA.pdb
in COX2N ---
Docking di CELAA.pdb
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
1) Preparate
il legando CELAA.pdbqt
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Lanciate AutoDockTools partendo
dall'icona sul desktop ---
> > > Impostate la directory COX2N come
directory di default in AutoDockTools ---
File => Preferences => Set
In Startup Directory scrivete => C:\COX2N premete Make
Default => Set => Dismiss
> > > Aprite il legando CELAA.pdb in
Autodock ---
Pulsante destro su All
Molecules => Read Molecule scegliete CELAA.pdb
=> Apri.
> > > Aggiungete
gli atomi di idrogeno a CELAA ---
Edit => Hydrogens => Add => OK
> > > Scegliete
CELAA come legando ---
Ligand => Input => Choose => CEL
=> Select Molecule for AutoDock 4 => OK
> > > Salvate
il legando in formato pdbqt --
Ligand => Output => Save as PDBQT => CELAA.pdbqt
=> Salva
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
2) Scrivete
il file config.txt dedicato
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
Usando notepad correggete il file config_3LN_CEL.txt scrivendo
CELAA al posto di CEL
Oppure copiate e incollate in notepad le seguenti righe:
receptor = 3LN.pdbqt
ligand = CELAA.pdbqt
center_x = 30.1
center_y = -22.6
center_z = -15.8
size_x = 32
size_y = 24
size_z = 24
out = 3LN_CELAA_vina.pdbqt
Salvate il file in COX2N col nome config_3LN_CELAA.txt
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
3) Lanciate
il docking
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Verificate che in C:/COX2N
siano presenti i seguenti file ---
3LN.pdbqt
CELAA.pdbqt
config_3LN_CELAA.txt
vina.exe
> > > Lanciate il docking ---
Cliccate Run => Run AutoDock Vina
in Vina Program Pathname cliccate => Browse => vina.exe
=> Apri
In Config Filename cliccate => Browse => config_3LN_CELAA.txt
=> Apri => Launch
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
4) Valutare
i risultati del docking
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Aprite il file che contiene i risultati
del docking di CELAA ---
Analize => Dockings => Open AutoDock Vina Results
=> 3LN_CELAA_vina.pdbqt => Apri => Single
molecule whith multiple conformations => OK
> > > Aprite il file che contiene i risultati
del docking di CEL fatto la lezione precedente ---
Analize => Dockings => Open AutoDock Vina
Results => 3LN_CEL_vina.pdbqt
> > > Colorate le due molecole come nella figura qui sotto
(fig.4) ---
Su 3LN_CELAA_vina => cerchietto B (Sticks and Balls)
colonna Cl => Balls, Sticks, Carbon only =>
Custom color (arancione)
Su 3LN_CEL_vina => cerchietto B => poi coloratelo
di verde
inoltre colorate d verde anche il punteggio
colonna Cl => Protein Labels => Custom Color
(verde)
Se l'immagine è un po' scura, alzate il valore di inizio di fog
nella finestra Tools.
La posa calcolata da AutoDock per il legando prodotto da Avogadro CELAA
(arancione) è quasi sovrapposta alla posa calcolata nella lezione
precedente per il legando originale CEL (verde).
Notate, però, che il punteggio del docking è lievemente
inferiore:
-12.4 kcal/mol usando CEL generato da Avogadro (CELAA, arancione),
-12.5 kcal/mol usando CEL ottenuto dalla cristallografia (CEL, verde).
Questi due valori sono così vicini che confermano l'affidabilità
di Avogadro nel creare molecole ben ottimizzate da usare nel docking.
In ogni modo, il valore di riferimento per valutare la bontà
dei prossimi docking che faremo in questa lezione, sarà -12.4
kcal/mol perchè creeremo ogni farmaco con Avogadro.
> > > Salvate la posa di CEL col nome
CEL_posa.pdb ---
Select (quadratino S) 3LN_CEL_vina (-12.5) => Save => Write
PDB => scrivete CEL_posa =>
OK
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figura 5
figura 6
figura 7
figura 8
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Prima variante
Per cominciare introduciamo in celecoxib, al posto del gruppo CF3,
un gruppo di acido propanoico con configurazione S come quello
che c'è nell'ibuprofene. Nella scorsa lezione, infatti, abbiamo
osservato che il carbossile dell'ibuprofene interagisce con una arginina
in COX2.
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
1) Preparate
con Avogadro il legando CELP.pdb
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Aprite con Avogadro il file CELAA.pdb che si trova in
COX2N ---
> > > Modificate il gruppo CF3
in acido propanoico (S) ---
Cliccate sulla matita (Draw Tool)
Con un click del pulsante destro cancellate il fluoro verso di voi,
(verrà sostituito da un idrogeno)
Togliete la spunta su Adjust Hydrogens
Su Element scegliete carbonio
Fate un click sugli altri due fluori per trasformarli entrambi in carboni
Scegliete quale dei due carboni deve diventare COOH per dare una configurazione
(S)
In figura 6: dato che H è verso di noi, ci deve essere rotazione
verso destra di COOH, anello, CH3
Attenzione, per muovere la molecola dovete uscire dalla modalità
Draw Tool cliccando sulla stellina blu (navigation Tool) poi tornate
su Draw per continuare a costruire la molecola.
Su Element scegliete ossigeno
Legate un ossigeno al carbonio che avete scelto con un click-trascina-rilascia
Scegliete doppio legame
Legate un ossigeno con doppio legame al carbonio con un click-trascina-rilascia.
(il doppio legame si può creare anche con un clic sul legame
singolo)
Otterrete l'immagine qui sotto (fig.6). Notate che le lunghezze dei
legami sono errate e mancano idrogeni
> > > Aggiungete gli idrogeni ---
Build => Add hydrogens => ok
> > > Ottimizzate la geometria ---
Cliccate su E (auto optimzation tool) => nel campo
Force Field scegliete MMFF94S => start
Quando ha raggiunto un minimo di energia, cliccate su stop.
> > > Salvate la molecola in COX2N col
nome CELP.pdb---
> > > Verificate con notepad che il nome
del ligando in CELP.pdb sia sempre LIG 1 ---
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
2) Preparate
il legando CELP.pdbqt
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Aprite il legando CELP.pdb in Autodock
---
> > > Aggiungete
gli atomi di idrogeno a CELP ---
> > > Scegliete
CELP come legando ---
> > > Salvate
il legando in formato pdbqt --
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
3) Scrivete
il file config.txt dedicato
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
receptor = 3LN.pdbqt
ligand = CELP.pdbqt
center_x = 30.1
center_y = -22.6
center_z = -15.8
size_x = 32
size_y = 24
size_z = 24
out = 3LN_CELP_vina.pdbqt
Salvate il file col nome config_3LN_CELP.txt
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
4) Lanciate
il docking
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Verificate che in C:/COX2N
siano presenti i seguenti file ---
3LN.pdbqt
CELP.pdbqt
config_3LN_CELP.txt
vina.exe
> > > Lanciate il docking ---
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
5) Valutate
i risultati del docking
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Caricate il file che contiene i
risultati del docking ---
Analize => Dockings => Open AutoDock Vina Results
=> 3LN_CELP_vina.pdbqt => Apri => Single
molecule whith multiple conformations => OK
> > > Caricate il file CEL_posa.pdbqt
che serve da confronto ---
Nell'immagine qui sotto (fig.7) si vede che CELP si è collocato
nel sito di legame di COX2 nello stesso modo del legando originale.
Verso l'alto si vede che il carbossile è rivolto verso l'arginina
sul retro della tasca (come ibuprofene), ma ha avuto un punteggio di
docking leggermente inferiore: -12.2 kcal/mol (contro -12.4)
Questa differenza di punteggio va presa con prudenza perchè i
fattori che influenzano l'interazione legando-enzima sono più
complessi di quelli considerati da AutoDock. Quindi possiamo concludere
che questa variante di celecoxib con acido propanoico (come ibuprofene)
potrebbe essere un ottimo farmaco antiinfiammatorio e avrebbe il pregio
di non contenere fluoro.
Nella figura qui sotto (fig.8) abbiamo rappresentato il nuovo legando
CELP circondato dagli amminoacidi della tasca di legame AA.pdb.
Si vede molto bene l'interazione tra il carbossile di CELP (a destra
in alto) e i gruppi amminici dell'arginina (sul davanti, blu) e il gruppo
OH (rosso) della tirosina (beige, in centro).
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figura 9
figura 10
figura 11
figura 12
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Seconda variante
Proviamo ora ad introdurre una modifica nell'anello benzenico in basso
di celecoxib, attorno al quale avevamo osservato, nella tasca di legame,
uno spazio disponibile in una zona sostanzialmente apolare.
Introduciamo un sostituente CH3
(apolare) come mostrato nella figura qui sotto (fig.9) con lo scopo di
riempire meglio questa zona della tasca. Chiameremo questa nuova molecola
CELC.
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
1) Preparate
con Avogadro la molecola CELC.pdb
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Aprite con Avogadro il file CELAA.pdb che si trova in COX2N
---
> > > Introducete un gruppo CH3
nella posizione in basso a sinistra dell'anello benzenico---
> > > Aggiungete gli idrogeni ---
> > > Ottimizzate la geometria ---
> > > Salvate la molecola in COX2N
col nome CELC.pdb---
> > > Verificate con notepad che il nome
del ligando in CELC.pdb sia sempre LIG 1 ---
Otterrete la molecola della figura seguente (fig.10)
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
2) Preparate
il legando CELC.pdbqt
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Aprite la molecola CELC.pdb in Autodock
---
> > > Scegliete
CELC come legando ---
> > > Salvate
il legando in formato pdbqt --
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
3) Scrivete
il file config.txt dedicato
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
receptor = 3LN.pdbqt
ligand = CELC.pdbqt
center_x = 30.1
center_y = -22.6
center_z = -15.8
size_x = 32
size_y = 24
size_z = 24
out = 3LN_CELC_vina.pdbqt
Salvate il file col nome config_3LN_CELC.txt
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
4) Lanciate
il docking
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Verificate che in C:/COX2N
siano presenti i seguenti file ---
3LN.pdbqt
CELC.pdbqt
config_3LN_CELC.txt
vina.exe
> > > Lanciate il docking ---
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
5) Valutate
i risultati del docking
>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>
> > > Caricate il file che contiene i risultati
del docking di CELC (su Analyze...) ---
> > > Caricate il file CEL_posa.pdbqt che
serve da confronto ---
Nella figura seguente si vede la posa di CELC arancione contro quella
di CEL (verde).
Il punteggio -12.9 kcal/mol significa che la posa è molto buona,
ha guadagnato 0.5 kcal/mol per l'interazione del gruppo CH3
con una parte sostanzialmente apolare della tasca.
Nell'immagine qui sotto (fig.12) si vede che il nuovo gruppo CH3
di CELC (in basso a sinistra), è relativamente vicino a due gruppi
OH di una serina (arancione a sinistra) e di una tirosina (beige in basso).
Se mettete un gruppo NH2
(invece del CH3)
il punteggio di docking peggiora (-12.5 kcal/mol).
Se mettete un gruppo OH (invece del CH3)
il punteggio di docking peggiora ancora (-12.3 kcal/mol).
Nulla si può dire sulle vere potenzialità di questa seconda
variante di celecoxib (CELC), ma, stando al punteggio del docking (-12.9
kcal/mol), questa molecola sembra molto promettente come farmaco antiinfiammatorio.
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figura 13
figura 14
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Terza e quarta variante
A questo punto potete provare tutte le varianti che vi vengono in mente.
Gli allievi di 4i che hanno affrontato questo problema hanno lavorato
per più giornate al computer. Una delle varianti più semplici
che ha dato ottimi risultati nel docking è stata le seguente CELCXF:
Questa variante ha dato un punteggio di docking -13.1 kcal/mol come si
vede nella seguente figura e il farmaco CELCXF (arancione) si è
collocato lievemente più in alto rispetto a CEL (verde).
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Il punteggio di docking può essere ulteriormente
migliorato.
Per esempio, trasformando il CH3 in basso
in CF3, si ottiene un punteggio di -13.3 kcal/mol,
come si vede nella figura qui sotto (Fig15). Il farmaco si è
collocato ancora più in alto nella tasca a causa dell'ingombro
sterico del nuovo gruppo CF3.
Naturalmente un nuovo CF3 appesantisce la
molecola, complica la sintesi del farmaco e pone nuovi problemi di metaboliti
nel corpo.
Il lavoro è solo cominciato, sperimentate in prima persona, provate
a introdurre nuovi sostituenti o anche a cambiare la logica degli anelli
e confrontate i vostri risultati con quelli proposti qui. Riuscite a
trovare varianti con punteggio ancora migliore?
Autore: prof Mauro Tonellato
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